《Advanced Science》解读：蛋白分子互作。MISP 通过 MST1/2 激酶促进NSCLC中 YAP 的激活
Hippo信号通路已成为一个关键的癌症信号网络。其中，MST1/2 对 YAP/TAZ 活性至关重要。目前尚不清楚癌症中 MST1/2 的活性是如何降低的。了解其肿瘤抑制活性是如何受到调节的，将有助于拓展在Hippo 信号通路中靶向 MST1/2 用于癌症治疗的潜力。
2025年4月，同济大学/中国科学技术大学研究人员合作在Advanced Science（IF=14.1）上发表了题为“MISP Suppresses Ferroptosis via MST1/2 Kinases to Facilitate YAP Activation in Non-Small Cell Lung Cancer”的研究成果。揭示MISP在非小细胞肺癌铁死亡调节中的关键作用，突出了其作为潜在治疗靶点的重要性。
图形摘要：
Highlights如下：
1）肺癌组织中的MISP表达显著上调，与患者的生存期和无病时间缩短相关；
2）MISP缺失使细胞对铁死亡敏感，从而在体外和体内降低细胞增殖；
3）机制上，MISP 与 MST1/2 丝裂激酶的 SARAH 结构域结合，抑制它们的同二聚化和自磷酸化，从而导致 Hippo 通路中的 YAP 继续激活。YAP 的激活会增加 SLC7A11 的表达，从而保护细胞免受铁死亡的侵害。此外，MISP是 YAP的一个靶点，这形成了一个反馈回路，从而增强了 YAP 的信号传递作用。临床相关性：MISP在NSCLC组织中表达显著上调达，MISP水平升高预示着肺癌患者的更差临床预后。功能研究：MISP 抑制铁死亡以促进肺癌细胞增殖。
机制研究：
（1）MISP 通过 Hippo-YAP 信号通路促进 SLC7A11 的表达
第一步，Hippo 信号通路对于 MISP 诱导SLC7A11 表达是必不可少的
为了阐明 MISP 抑制铁死亡的机制，对TCGA的肺癌组织转录组数据集进行GSEA分析，发现MISP 的高表达与Hippo 信号通路呈正相关（图1a），还与铁死亡正相关（图1b）。SLC7A11是一种由氧化应激诱导的铁死亡抑制剂。推测在铁死亡的调节中可能存在 MISP-SLC7A11轴。假设 MISP 可能通过 Hippo 信号通路调节 SLC7A11 介导的铁死亡。敲减MISP 发现，SLC7A11 以及CYR61 和 CTGF（这两个已被证实为 YAP 目标基因）的表达降低，而在缺乏 YAP 的细胞中未观察到这种效应（图1c-d）。表明 Hippo 信号通路对于 MISP 诱导 SLC7A11 表达是必不可少的。
第二步，MISP 对 YAP/TEAD 信号通路具有正向调节作用
质核分离western blot实验发现，敲除MISP可增强YAP 的核外排（图1e）。同时，敲除MISP降低SLC7A11、YAP 和 CYR61 的水平，增加YAP 的磷酸化水平（图1f）。TEAD 反应型荧光素酶报告基因（8XGITTC）实验，观察到在 MISP 敲低的细胞中，荧光素酶报告基因活性受损（图1g），进一步表明 MISP 对YAP/TEAD 信号通路具有正向调节作用。
第三步，MISP 通过 14-3-3 抑制YAP 降解
考虑到 YAP 的磷酸化和胞质滞留通常会导致其在 依赖14-3-3 的方式下被泛素化并随后降解，试图确定 MISP 是否能通过 14-3-3 保护 YAP 避免降解。一致地，Co-IP分析发现，MISP 的缺失导致YAP 与 14-3-3 的相互作用增加、YAP 的泛素化增强（图1h-i），MISP 过表达则结果相反（图1j-m）。表明 MISP 确实通过14-3-3 起到防止 YAP 降解的关键作用。综上所述，MISP 作为 Hippo 信号通路的新调节因子发挥作用，刺激SLC7A11 的表达。
图1 MISP 通过Hippo-YAP 信号通路促进 SLC7A11 的表达，MISP是 Hippo-YAP 信号通路的一个靶点（Ref. Fig. 3/4/S3）
（2）MISP 与 MST1/2 激酶结合
为了阐明 MISP 调控Hippo 信号通路的具体机制，Co-IP和LC-MS确定这一信号级联反应中 MISP 的潜在结合伙伴。其中MST1被确认为一个候选蛋白（图2a）。内源、外源Co-IP实验显示MISP与 MST1/2 之间的存在相互作用（图2b-d）。为了进一步确定这种相互作用所涉及的特定区域，分别构建MISP 和 MST1/2截断体，进行Co-IP分析，发现MISP 中352-524 的氨基酸（aa352-524）对于其与 MST1/2 的相互作用是必不可少的（图2e）；而 MST1/2 的C 端 SARAH 结构域 aa431-487 则介导与 MISP 的结合（图2f）。此外，GST pulldown实验也证实MISP 的 aa352-524 区域与MST1/2 的 SARAH 结构域之间存在直接相互作用（图2g）。为调节 Hippo 信号通路的新的 MISP-MST1/2 轴提供了证据。
图2 MISP 与 MST1/2 激酶结合（Ref. Fig. 5/S5）
（3）MISP 抑制 MST1/2 的同源二聚化及激活过程
第一步，MISP中R390 和 R391对其与MST1/2 的互作以及随后的YAP 激活至关重要
为了确定 MISP 与MST1/2 之间相互作用所必需的关键最小氨基酸，对 MISP 的氨基酸序列 352-524 进行缺失突变。Co-IP分析显示最小的 aa382-396 对它们的结合是必不可少的（图3a-b）。利用 AlphaFold 3 进行分子对接确定在相互作用界面的两个关键精氨酸残基，即R390 和 R391。Co-IP分析提示，将 R390 和 R391 用丙氨酸取代（R2A）完全消除了其与 MST1 和 MST2 的结合（图3c-d）。此外，R2A突变体在诱导YAP激活和刺激靶基因表达方面存在缺陷（图3e）。与野生型 MISP 表达的细胞相比，表达 R2A 突变的细胞显示出 YAP 核转位的减少以及 TEAD 荧光报告活性的降低（图3f-g）。另外，Co-IP分析发现，与野生型 MISP 相比，含有 R2A 突变体的细胞中 YAP 与14-3-3 的结合以及泛素化作用显著增强（图3h-i）。表明R390和 R391 在 MISP 中对于其与 MST1/2 的相互作用以及随后的 YAP 激活起着至关重要的作用。
第二步，MISP与 MST1/2 激酶相互作用，以限制 MST1/2 的同二聚化和激活
由于 SARAH 结构域对于MST1/2 激酶的同二聚化以及随后的自磷酸化至关重要，试图确定 SARAH 结构域与 MISP 的结合是否会影响 MST1/2 激酶的同二聚化和激活。Co-IP分析显示加入 MISP 显著阻止 MST1/2 之间的相互作用（图 3j-k），并抑制MST 激酶的磷酸化（图 3l）；相反，在缺失 MISP 的细胞中，MST1/2 的磷酸化显著增强（图 3m）。表明 MISP 确实调节了 MST1/2 激酶的二聚化和自磷酸化。此外，与 MISP 不同的是，MISP R2A 突变体未能抑制 MST1/2 激酶的二聚化和自磷酸化（图 3n-o）。表明MISP抑制铁死亡依赖于其与MST激酶的结合和随后的激活。
总的来说，这些结果表明MISP与MST1/2激酶相互作用，限制了MST1/2同型二聚化和激活。
图3 MISP 抑制 MST1/2 的同源二聚化及激活过程（Ref. Fig. 6/S6）
结论：本研究发现MISP是 NSCLC 中铁死亡的显著抑制因子。MISP 在 NSCLC 组织中表达上调，其缺失会使细胞对铁死亡更敏感，从而在体外和体内减少细胞增殖。机制上，MISP 与 MST1/2 丝裂激酶的SARAH 结构域结合，抑制它们的同二聚化和自磷酸化，导致 Hippo 信号通路中的 YAP 持续激活。YAP 的激活会增加SLC7A11 的表达，从而保护细胞免受铁死亡的侵害。此外，还发现MISP-R390/391A位点突变破坏MISP与 MST1/2 的结合，揭示了MST1/2 依赖性的 Hippo 信号通路抑制作用。另外，MISP是 YAP 的靶点，形成了一个YAP 信号的反馈回路。提示存在一种新的 MISP-YAP 轴来调控铁死亡，使MISP 成为一种针对NSCLC的潜在治疗靶点，尤其是在 YAP 功能失调的病例中。
Hippo信号通路已成为一个关键的癌症信号网络。其中，MST1/2 对 YAP/TAZ 活性至关重要。目前尚不清楚癌症中 MST1/2 的活性是如何降低的。了解其肿瘤抑制活性是如何受到调节的，将有助于拓展在Hippo 信号通路中靶向 MST1/2 用于癌症治疗的潜力。
2025年4月，同济大学/中国科学技术大学研究人员合作在Advanced Science（IF=14.1）上发表了题为“MISP Suppresses Ferroptosis via MST1/2 Kinases to Facilitate YAP Activation in Non-Small Cell Lung Cancer”的研究成果。揭示MISP在非小细胞肺癌铁死亡调节中的关键作用，突出了其作为潜在治疗靶点的重要性。
图形摘要：
Highlights如下：
1）肺癌组织中的MISP表达显著上调，与患者的生存期和无病时间缩短相关；
2）MISP缺失使细胞对铁死亡敏感，从而在体外和体内降低细胞增殖；
3）机制上，MISP 与 MST1/2 丝裂激酶的 SARAH 结构域结合，抑制它们的同二聚化和自磷酸化，从而导致 Hippo 通路中的 YAP 继续激活。YAP 的激活会增加 SLC7A11 的表达，从而保护细胞免受铁死亡的侵害。此外，MISP是 YAP的一个靶点，这形成了一个反馈回路，从而增强了 YAP 的信号传递作用。临床相关性：MISP在NSCLC组织中表达显著上调达，MISP水平升高预示着肺癌患者的更差临床预后。功能研究：MISP 抑制铁死亡以促进肺癌细胞增殖。
机制研究：
（1）MISP 通过 Hippo-YAP 信号通路促进 SLC7A11 的表达
第一步，Hippo 信号通路对于 MISP 诱导SLC7A11 表达是必不可少的
为了阐明 MISP 抑制铁死亡的机制，对TCGA的肺癌组织转录组数据集进行GSEA分析，发现MISP 的高表达与Hippo 信号通路呈正相关（图1a），还与铁死亡正相关（图1b）。SLC7A11是一种由氧化应激诱导的铁死亡抑制剂。推测在铁死亡的调节中可能存在 MISP-SLC7A11轴。假设 MISP 可能通过 Hippo 信号通路调节 SLC7A11 介导的铁死亡。敲减MISP 发现，SLC7A11 以及CYR61 和 CTGF（这两个已被证实为 YAP 目标基因）的表达降低，而在缺乏 YAP 的细胞中未观察到这种效应（图1c-d）。表明 Hippo 信号通路对于 MISP 诱导 SLC7A11 表达是必不可少的。
第二步，MISP 对 YAP/TEAD 信号通路具有正向调节作用
质核分离western blot实验发现，敲除MISP可增强YAP 的核外排（图1e）。同时，敲除MISP降低SLC7A11、YAP 和 CYR61 的水平，增加YAP 的磷酸化水平（图1f）。TEAD 反应型荧光素酶报告基因（8XGITTC）实验，观察到在 MISP 敲低的细胞中，荧光素酶报告基因活性受损（图1g），进一步表明 MISP 对YAP/TEAD 信号通路具有正向调节作用。
第三步，MISP 通过 14-3-3 抑制YAP 降解
考虑到 YAP 的磷酸化和胞质滞留通常会导致其在 依赖14-3-3 的方式下被泛素化并随后降解，试图确定 MISP 是否能通过 14-3-3 保护 YAP 避免降解。一致地，Co-IP分析发现，MISP 的缺失导致YAP 与 14-3-3 的相互作用增加、YAP 的泛素化增强（图1h-i），MISP 过表达则结果相反（图1j-m）。表明 MISP 确实通过14-3-3 起到防止 YAP 降解的关键作用。综上所述，MISP 作为 Hippo 信号通路的新调节因子发挥作用，刺激SLC7A11 的表达。
图1 MISP 通过Hippo-YAP 信号通路促进 SLC7A11 的表达，MISP是 Hippo-YAP 信号通路的一个靶点（Ref. Fig. 3/4/S3）
（2）MISP 与 MST1/2 激酶结合
为了阐明 MISP 调控Hippo 信号通路的具体机制，Co-IP和LC-MS确定这一信号级联反应中 MISP 的潜在结合伙伴。其中MST1被确认为一个候选蛋白（图2a）。内源、外源Co-IP实验显示MISP与 MST1/2 之间的存在相互作用（图2b-d）。为了进一步确定这种相互作用所涉及的特定区域，分别构建MISP 和 MST1/2截断体，进行Co-IP分析，发现MISP 中352-524 的氨基酸（aa352-524）对于其与 MST1/2 的相互作用是必不可少的（图2e）；而 MST1/2 的C 端 SARAH 结构域 aa431-487 则介导与 MISP 的结合（图2f）。此外，GST pulldown实验也证实MISP 的 aa352-524 区域与MST1/2 的 SARAH 结构域之间存在直接相互作用（图2g）。为调节 Hippo 信号通路的新的 MISP-MST1/2 轴提供了证据。
图2 MISP 与 MST1/2 激酶结合（Ref. Fig. 5/S5）
（3）MISP 抑制 MST1/2 的同源二聚化及激活过程
第一步，MISP中R390 和 R391对其与MST1/2 的互作以及随后的YAP 激活至关重要
为了确定 MISP 与MST1/2 之间相互作用所必需的关键最小氨基酸，对 MISP 的氨基酸序列 352-524 进行缺失突变。Co-IP分析显示最小的 aa382-396 对它们的结合是必不可少的（图3a-b）。利用 AlphaFold 3 进行分子对接确定在相互作用界面的两个关键精氨酸残基，即R390 和 R391。Co-IP分析提示，将 R390 和 R391 用丙氨酸取代（R2A）完全消除了其与 MST1 和 MST2 的结合（图3c-d）。此外，R2A突变体在诱导YAP激活和刺激靶基因表达方面存在缺陷（图3e）。与野生型 MISP 表达的细胞相比，表达 R2A 突变的细胞显示出 YAP 核转位的减少以及 TEAD 荧光报告活性的降低（图3f-g）。另外，Co-IP分析发现，与野生型 MISP 相比，含有 R2A 突变体的细胞中 YAP 与14-3-3 的结合以及泛素化作用显著增强（图3h-i）。表明R390和 R391 在 MISP 中对于其与 MST1/2 的相互作用以及随后的 YAP 激活起着至关重要的作用。
第二步，MISP与 MST1/2 激酶相互作用，以限制 MST1/2 的同二聚化和激活
由于 SARAH 结构域对于MST1/2 激酶的同二聚化以及随后的自磷酸化至关重要，试图确定 SARAH 结构域与 MISP 的结合是否会影响 MST1/2 激酶的同二聚化和激活。Co-IP分析显示加入 MISP 显著阻止 MST1/2 之间的相互作用（图 3j-k），并抑制MST 激酶的磷酸化（图 3l）；相反，在缺失 MISP 的细胞中，MST1/2 的磷酸化显著增强（图 3m）。表明 MISP 确实调节了 MST1/2 激酶的二聚化和自磷酸化。此外，与 MISP 不同的是，MISP R2A 突变体未能抑制 MST1/2 激酶的二聚化和自磷酸化（图 3n-o）。表明MISP抑制铁死亡依赖于其与MST激酶的结合和随后的激活。
总的来说，这些结果表明MISP与MST1/2激酶相互作用，限制了MST1/2同型二聚化和激活。
图3 MISP 抑制 MST1/2 的同源二聚化及激活过程（Ref. Fig. 6/S6）
结论：本研究发现MISP是 NSCLC 中铁死亡的显著抑制因子。MISP 在 NSCLC 组织中表达上调，其缺失会使细胞对铁死亡更敏感，从而在体外和体内减少细胞增殖。机制上，MISP 与 MST1/2 丝裂激酶的SARAH 结构域结合，抑制它们的同二聚化和自磷酸化，导致 Hippo 信号通路中的 YAP 持续激活。YAP 的激活会增加SLC7A11 的表达，从而保护细胞免受铁死亡的侵害。此外，还发现MISP-R390/391A位点突变破坏MISP与 MST1/2 的结合，揭示了MST1/2 依赖性的 Hippo 信号通路抑制作用。另外，MISP是 YAP 的靶点，形成了一个YAP 信号的反馈回路。提示存在一种新的 MISP-YAP 轴来调控铁死亡，使MISP 成为一种针对NSCLC的潜在治疗靶点，尤其是在 YAP 功能失调的病例中。
