技术科普--表达一个蛋白的简单过程~

如何获得所需的蛋白、基因？
在获取一种蛋白之前，先要找到该蛋白的基因序列，我们知道了它的名字，就可以到数据库里进行搜索。有很多免费的数据库资源，比如NCBI。
找到蛋白，再找到它的DNA序列。
然后针对这段序列设计引物，找到模板或基因组，用PCR的方法扩增出来。
当然，如果你有钱，可以直接买或者合成。

介绍下PCR：
那个黄黄的是引物哈

过程就如图上所画，双链DNA高温变性，变成单链DNA，然后退火，此时引物与模板结合，在DNA聚合酶的作用下延伸，合成有双链DNA，这么一个过程下来，DNA扩增了两倍。继续变性-退火-延伸，DNA再次扩增。
其实引物与模板的配对没有那么严格，可以在引物设计时加上各种位点和标记，方便下一步的操作。

我们现在已经把基因扩增出来了，而PCR扩增出来的量还远远达不到我们的需求，而且容易降解，那么，怎么来将它进一步扩增，并且保存呢？
上载体。

可载体又是什么呢？
细菌的细胞质内存在着一种基因组外DNA，就是我们所说的质粒，呈环状，根据其复制子的不同可以跟着基因组一起复制，也可以自主复制。质粒经过人工改造过以后，就成了基因工程常用的载体，种类繁多，就不介绍啦。

质粒载体又分克隆载体和表达载体，克隆载体是用来大规模扩增的，而表达载体顾名思义就是用来表达的。
我们先要扩增，就先把扩增出来的基因放到克隆载体上吧~

说个最简单的TA克隆：Taq DNA聚合酶有一个特点，就是喜欢在自己扩增的片段末尾加上一个A碱基，而专门针对它设计的T载体就诞生了。

两个片段之间的缝隙用DNA连接酶一连，就华丽丽的完成了。

然后我们要将改造完成的质粒导入细胞中去。受体细胞选择扩增快的，结构简单的，比如，大肠杆菌。

在把改造完的质粒导入大肠杆菌之前，要先将受体细胞进行处理。一般细菌是不会摄取细胞外的DNA的，我们要让它成为“感受态”，就是变成非常容易把DNA“吃”进去的状态。
最常用的方法是钙处理法，就是用含钙离子的溶液处理大肠杆菌，钙便沉积在细胞膜的表面，使其变得非常脆弱，然后把我们改造完的载体放到体系里面，让载体粘附在细胞膜表面，这时给它一个瞬时的高温，使细胞膜开一道口子，把黏在外面的DNA吞进去。
这样，我们的载体导入就完成了，现在要做的，就是把大肠杆菌养起来，改造完的载体也就可以大量地扩增了。

得到了足够多的基因片段，也解决了基因的保存问题，现在，就要让它表达了。
这时候，就要将克隆质粒从受体细胞中抽取出来，将基因片段切下来（酶切位点都已在克隆载体上设计好了，很方便），将表达载体同样地酶切，这样，两个相同粘性末端的片段又可以用DNA连接酶连接起来了。



现在，再次把改造完的表达载体放入受体细胞中，这一次，要让它表达。

学过中心法则都知道，生物的基因表达基础都是一样的，但是为什么不同的基因在某些组织细胞中能表达，而另一些却不可以呢？

这很大程度上与基因的特异性启动子有关，启动子一般位于基因的上游，与RNA聚合酶识别结合，能识别，那就可以进行转录，继而翻译成蛋白；不能，这个基因就不能表达。
所以，如果不能表达，没关系，最简单直接的方法，就是换个启动子。

这下，我们就可以得到目的蛋白了。可是我们所要的蛋白混在一大堆无关的蛋白中，怎么把它纯化出来呢？

还记得之前说过的在扩增引物上加标记么？

在引物上加个标签，就在你扩增的基因上加个标签，然后纯化时找专门结合这个标签的纯化柱就可以了。
把细胞裂解开，让蛋白通过这个柱子，咱们的目的蛋白就留在了纯化柱子上，用一种溶液洗洗，把杂蛋白都洗掉，再换一种溶液洗洗，把目的蛋白洗下来。

这样，就得到所需要的蛋白了。



当然，蛋白纯化是一门非常深奥玄妙的专业，有非常多非常多的方法，对于我这种脑袋简单的人来说实在是太难了，就不多说了。