一.实验材料
细胞：SW480
培养基：无血清培养基，含10%FBS的完全培养基
耗材：预冷枪头、预冷离心管和放有Transwell小室的预冷24孔板
其他：胰酶，PBS，结晶紫染液，甲醇，Matrigengel（ABW货号：082704）
二. 实验步骤
A. 准备基质胶
1. 4℃解冻Matrigengel，实验前转移到冰盒中。（注意：同样要准备一些4℃预冷的枪头用于吸取Matrigengel）
2. 将枪头、离心管与放有Transwell小室的24孔板放入冰箱预冷。冰上操作。Matrigengel 用预冷枪头混匀。
B. 基质胶铺板
1.稀释Matrigengel：Matrigengel：无血清培养基=1:4，1:6，1：8。
2.吸取60µL 稀释后的Matrigengel，加入Transwewll上室中，均匀平铺在底部。放入培养箱（37℃，5%CO2)中孵育3h，使Matrigengel聚合成凝胶。
3.吸出培养板中残余液体，每孔加入50uL无血清培养液，37℃，30min。进行基底膜水化。（注意：铺胶过程不要产生气泡，均匀铺胶。）
C. 制作细胞悬液
1.制作细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
2.取对数生长期的细胞，经消化、离心、计数后，用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液。调整细胞密度至8×105个/mL。
D. 接种细胞
1.在24孔板下室加入500µL含10%FBS的培养基。然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内（注意：下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。）
2.按照200µL每孔，将细胞悬液加入Transwell上室中。
3.放入培养箱培养48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。（建议：最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生）
E. 细胞固定
1.取出Transwell小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigengel和上室内的细胞。
2.在新的24孔板加入甲醇600µL，将小室放入后固定20-30min。
F. 细胞染色及计数
1.弃固定液，用PBS洗1次，用0.1%结晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。
2.适当风干后，在高倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。
稀释1:4倍 稀释1:6倍 稀释1:8倍
图 1. 稀释4倍、6倍、8倍图片
稀释1:4倍 稀释1:6倍 稀释1:8倍
图 2. 稀释4倍、6倍、8倍时固定液中穿过细胞图片
此次实验中，采用SW480细胞，接种细胞是8×105个/mL，基质胶铺板比例是1:4、1:6、1:8，侵袭时间是48h，用甲醇固定30min，0.1%结晶紫染液染色5min后观察的。观察到有较少的细胞迁移，其中稀释6倍的基质胶中穿过的细胞最多，1:4次之，1:8最少。在实验过程中，有注意到将小室放入下室甲醇固定液后，立马有细胞漂浮在下室甲醇固定液中。后来染色过程中，用棉签擦去未于细胞结合的结晶紫时，几乎就没啥细胞了。
反思：本次实验接种细胞数目、侵袭时间24-48h均是查找的，可能是侵袭48h太久了，导致很多细胞都穿到下室去了。
附件：
1.ABW基质胶的使用
1.基质胶颜色的变化可能发生在冷冻或解冻ABW基质胶药瓶的过程中，由于二氧化碳与重碳酸盐缓冲液和酚红的相互作用，颜色会从淡黄色变化到深红色。颜色的变化是正常的， 不影响产品功效，在与5%的二氧化碳平衡后颜色将消失。
2.在冰上4°C 解冻ABW基质胶。一旦解冻，旋转药瓶以确保材料均匀分散。向药瓶的顶端喷洒70%乙醇，并在空气中干燥。将产品放置在冰上，处理时请使用无菌操作。利用预冷的移液管、吸头和管分装材料，并立即冷冻。避免反复冻融。
2.预防措施
ABW基质胶在22°C 到35°C 将快速凝胶化。请在冰上4°C 过夜解冻。在使用前请将产品放置在冰上，当准备使用ABW基质胶是，请预冷移液管、吸头和管。
3.包被程序
注意：一旦凝胶化，ABW Matrigengel基质应该被立即使用。我们推荐至少10mg/mL浓度的蛋白和ABW基质胶一起使用。ABW基质胶的浓度是批次特异的，并且以分析证明书为基础。您可以预先检查基质的批次，通过联系ABW来预定适合您蛋白浓度的特定批次的ABW基质胶。
按推荐的方法解冻ABW基质胶。使用预冷的移液管，均匀的混合。
将24孔细胞培养板放置在冰上，向每个孔中加入0.289 mL冷冻的ABW基质胶(10 mg/mL)。该量对于覆盖整个生长表面应该是足够的。如果ABW基质胶需要稀释到10 mg/mL，请使用无血清培养基稀释。
在移液管吸取液体加入到每个孔中时，请避免气泡。如果孔中含有气泡，请在4°C 预冷的离心机中将培养板离心300xg，10分钟。
在37°C培养30-60分钟。
细胞：SW480
培养基：无血清培养基，含10%FBS的完全培养基
耗材：预冷枪头、预冷离心管和放有Transwell小室的预冷24孔板
其他：胰酶，PBS，结晶紫染液，甲醇，Matrigengel（ABW货号：082704）
二. 实验步骤
A. 准备基质胶
1. 4℃解冻Matrigengel，实验前转移到冰盒中。（注意：同样要准备一些4℃预冷的枪头用于吸取Matrigengel）
2. 将枪头、离心管与放有Transwell小室的24孔板放入冰箱预冷。冰上操作。Matrigengel 用预冷枪头混匀。
B. 基质胶铺板
1.稀释Matrigengel：Matrigengel：无血清培养基=1:4，1:6，1：8。
2.吸取60µL 稀释后的Matrigengel，加入Transwewll上室中，均匀平铺在底部。放入培养箱（37℃，5%CO2)中孵育3h，使Matrigengel聚合成凝胶。
3.吸出培养板中残余液体，每孔加入50uL无血清培养液，37℃，30min。进行基底膜水化。（注意：铺胶过程不要产生气泡，均匀铺胶。）
C. 制作细胞悬液
1.制作细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
2.取对数生长期的细胞，经消化、离心、计数后，用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液。调整细胞密度至8×105个/mL。
D. 接种细胞
1.在24孔板下室加入500µL含10%FBS的培养基。然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内（注意：下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。）
2.按照200µL每孔，将细胞悬液加入Transwell上室中。
3.放入培养箱培养48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。（建议：最好接种细胞后1-2h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生）
E. 细胞固定
1.取出Transwell小室，吸走培养基，用棉签轻轻擦拭Matrigengel和上室内的细胞。
2.在新的24孔板加入甲醇600µL，将小室放入后固定20-30min。
F. 细胞染色及计数
1.弃固定液，用PBS洗1次，用0.1%结晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。
2.适当风干后，在高倍显微镜下选取5个视野观察细胞并计数。
稀释1:4倍 稀释1:6倍 稀释1:8倍
图 1. 稀释4倍、6倍、8倍图片
稀释1:4倍 稀释1:6倍 稀释1:8倍
图 2. 稀释4倍、6倍、8倍时固定液中穿过细胞图片
此次实验中，采用SW480细胞，接种细胞是8×105个/mL，基质胶铺板比例是1:4、1:6、1:8，侵袭时间是48h，用甲醇固定30min，0.1%结晶紫染液染色5min后观察的。观察到有较少的细胞迁移，其中稀释6倍的基质胶中穿过的细胞最多，1:4次之，1:8最少。在实验过程中，有注意到将小室放入下室甲醇固定液后，立马有细胞漂浮在下室甲醇固定液中。后来染色过程中，用棉签擦去未于细胞结合的结晶紫时，几乎就没啥细胞了。
反思：本次实验接种细胞数目、侵袭时间24-48h均是查找的，可能是侵袭48h太久了，导致很多细胞都穿到下室去了。
附件：
1.ABW基质胶的使用
1.基质胶颜色的变化可能发生在冷冻或解冻ABW基质胶药瓶的过程中，由于二氧化碳与重碳酸盐缓冲液和酚红的相互作用，颜色会从淡黄色变化到深红色。颜色的变化是正常的， 不影响产品功效，在与5%的二氧化碳平衡后颜色将消失。
2.在冰上4°C 解冻ABW基质胶。一旦解冻，旋转药瓶以确保材料均匀分散。向药瓶的顶端喷洒70%乙醇，并在空气中干燥。将产品放置在冰上，处理时请使用无菌操作。利用预冷的移液管、吸头和管分装材料，并立即冷冻。避免反复冻融。
2.预防措施
ABW基质胶在22°C 到35°C 将快速凝胶化。请在冰上4°C 过夜解冻。在使用前请将产品放置在冰上，当准备使用ABW基质胶是，请预冷移液管、吸头和管。
3.包被程序
注意：一旦凝胶化，ABW Matrigengel基质应该被立即使用。我们推荐至少10mg/mL浓度的蛋白和ABW基质胶一起使用。ABW基质胶的浓度是批次特异的，并且以分析证明书为基础。您可以预先检查基质的批次，通过联系ABW来预定适合您蛋白浓度的特定批次的ABW基质胶。
按推荐的方法解冻ABW基质胶。使用预冷的移液管，均匀的混合。
将24孔细胞培养板放置在冰上，向每个孔中加入0.289 mL冷冻的ABW基质胶(10 mg/mL)。该量对于覆盖整个生长表面应该是足够的。如果ABW基质胶需要稀释到10 mg/mL，请使用无血清培养基稀释。
在移液管吸取液体加入到每个孔中时，请避免气泡。如果孔中含有气泡，请在4°C 预冷的离心机中将培养板离心300xg，10分钟。
在37°C培养30-60分钟。
