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酵母转化子鉴定求解
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渐变水獭
生物分子
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构建的质粒转化进酵母后,想鉴定一下质粒在不在,但普通的菌p扩增不出来,也试过用沸水浴冷冻和乙酸乙酯方法,也出不来。想找一种简便的方法(不使用酶),可以快速鉴定酵母中的转化子。求大佬帮帮忙
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1楼
2024-04-24 15:52
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霜刃十年犹未冷
原核生物
3
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在处理构建的质粒转化进酵母后无法通过普通方法鉴定的问题时,以下是一些有效的策略和论据,可以帮助你解决这个问题。
采用碱裂解法
碱裂解法是一种简便且常用的DNA提取方法。尽管常用于细菌质粒的提取,它在酵母质粒提取上也有应用。以下是碱裂解法的基本步骤:
细胞收集:收集酵母细胞,通常通过离心沉淀。
裂解缓冲液处理:加入含有NaOH和SDS的裂解缓冲液,这将破坏细胞壁并释放质粒DNA。
中和:用中和缓冲液中和碱性溶液。
离心:离心后,质粒DNA会在上清液中。
纯化:上清液经过乙醇沉淀或异丙醇沉淀后,可以得到纯化的质粒DNA。
利用玻璃珠破碎法
玻璃珠破碎法是一种物理方法,利用玻璃珠在高速旋转下机械破碎细胞壁,从而释放质粒DNA。
细胞悬浮:将酵母细胞悬浮于适当的裂解缓冲液中。
加入玻璃珠:加入直径0.5mm的玻璃珠。
机械破碎:使用Bead Beater等设备高速震荡,破碎细胞壁。
提取DNA:通过离心分离得到上清液,其中含有质粒DNA。
微波法
微波法是一种简单快捷的方法,可以用于细胞破碎和质粒提取。
细胞悬浮:将酵母细胞悬浮于少量水中。
微波处理:将悬浮液置于微波炉中加热30秒至1分钟,细胞壁在高温下破碎。
离心:离心分离,收集上清液。
DNA检测:直接用上清液进行PCR检测质粒DNA。
有些人可能会认为这些方法不如使用酶来得精确,但实际上,这些物理和化学方法提供了简便且经济的选择,尤其是在实验室资源有限的情况下。此外,这些方法的成功率在文献中也有较多支持,可以作为有效的替代方案。
碱裂解法、玻璃珠破碎法和微波法均是简单有效的非酶法,可以快速鉴定酵母中的转化子。这些方法不仅操作简便,而且成本低廉,适用于各种实验室条件。通过尝试这些方法,应该能有效解决质粒鉴定的问题。
IP属地:湖北
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2楼
2024-06-13 10:14
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