什么是RNA提取
细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白,DNA等杂质,最终获得高纯度RNA产物的过程。
RNA提取的使用目的
通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA,可用于实时荧光定量PCR、Northern blot、microRNA检测、芯片分析, DNA文库构建,基因克隆等实验。RNA用于不同的后续实验,其质量要求不尽相同。
cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留;
Northern对RNA完整性要求较高,对酶反应抑制物残留要求较低;
RT-PCR对RNA完整性要求不太高,但对酶反应抑制物残留要求严格。因此,明确实验目的是进行后续实验的首要条件。
RNA提取的方法
RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在匀质化或溶解样品中,Trizol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可从中间相沉淀得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
RNA提取实验操作步骤准备试剂:
氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。
操作步骤:
1.匀浆处理
a)植物组织:
以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.,大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.
b)动物组织:
以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.
c)单层培养细胞.
直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.
注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.
d)细胞悬液:
离心取细胞,每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞,以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。
e)血液处理:
直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10min,10 000rpm 离心1min。弃上清,收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
2.将匀浆样品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:4 ℃ 10 000rpm离心10min,取上清。
1.如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等,可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂,应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4.每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s,室温放置3min。如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替。
5.4 ℃ 10 000rpm离心10-15min,样品会分成三层:红色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约600ul,约为所用Trizol试剂的60%)转移到新管中。(如要分离蛋白质和DNA,可保留黄色的有机相)
6.在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃ 放置20-30min。
2.植物或动物组织RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染:在上清中加入1/2体积的异丙醇,1/2体积的RNA助沉剂,然后进行以下操作。
7.4 ℃ 10 000rpm离心10min,去上清。
3.离心前RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8.加入1ml 75%乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
9.4 ℃ 10 000rpm离心2min,弃上清;短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀。
10.室温放置晾干(不要晾得过干,RNA完全干燥后会很难溶解,大约晾干2-3min左右即可)。加入适量DEPC水(根据实验需要,可加30-100ul水)或0.5%SDS,用枪头吸打几次,充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。
RNA提取的注意事项
1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) :
加800ul Trizol,样品裂解后加氯仿,分层,沉淀RNA前,加5-10ug RNase-free糖原,糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成,也不影响PCR反应。
2. 匀浆后,加氯仿前,样品可在-70 ℃放置一个月以上:
RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上。如果要长期保存,RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中,-70 ℃长期保存。
细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白,DNA等杂质,最终获得高纯度RNA产物的过程。
RNA提取的使用目的
通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA,可用于实时荧光定量PCR、Northern blot、microRNA检测、芯片分析, DNA文库构建,基因克隆等实验。RNA用于不同的后续实验,其质量要求不尽相同。
cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留;
Northern对RNA完整性要求较高,对酶反应抑制物残留要求较低;
RT-PCR对RNA完整性要求不太高,但对酶反应抑制物残留要求严格。因此,明确实验目的是进行后续实验的首要条件。
RNA提取的方法
RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在匀质化或溶解样品中,Trizol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可从中间相沉淀得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
RNA提取实验操作步骤准备试剂:
氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。
操作步骤:
1.匀浆处理
a)植物组织:
以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.,大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.
b)动物组织:
以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.
c)单层培养细胞.
直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.
注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.
d)细胞悬液:
离心取细胞,每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞,以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。
e)血液处理:
直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10min,10 000rpm 离心1min。弃上清,收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
2.将匀浆样品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:4 ℃ 10 000rpm离心10min,取上清。
1.如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等,可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂,应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4.每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s,室温放置3min。如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替。
5.4 ℃ 10 000rpm离心10-15min,样品会分成三层:红色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约600ul,约为所用Trizol试剂的60%)转移到新管中。(如要分离蛋白质和DNA,可保留黄色的有机相)
6.在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃ 放置20-30min。
2.植物或动物组织RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染:在上清中加入1/2体积的异丙醇,1/2体积的RNA助沉剂,然后进行以下操作。
7.4 ℃ 10 000rpm离心10min,去上清。
3.离心前RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8.加入1ml 75%乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
9.4 ℃ 10 000rpm离心2min,弃上清;短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀。
10.室温放置晾干(不要晾得过干,RNA完全干燥后会很难溶解,大约晾干2-3min左右即可)。加入适量DEPC水(根据实验需要,可加30-100ul水)或0.5%SDS,用枪头吸打几次,充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。
RNA提取的注意事项
1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) :
加800ul Trizol,样品裂解后加氯仿,分层,沉淀RNA前,加5-10ug RNase-free糖原,糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成,也不影响PCR反应。
2. 匀浆后,加氯仿前,样品可在-70 ℃放置一个月以上:
RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上。如果要长期保存,RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中,-70 ℃长期保存。
