乳酸丰富是肿瘤的结果,肿瘤即使在含氧量正常的情况下,也会利用糖酵解作为能量代谢的主要来源,这种Warburg效应,促使肿瘤细胞具有丰富的乳酸代谢特征。存在即合理,肿瘤乳酸的促癌机制,是肿瘤靶点开发的重要内容。
2024年3月,同济大学、复旦大学及安徽科技大学等多单位合作在J Clin Invest(IF=13.3)上,发表“The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer”的研究成果,研究发现tRNA合成酶丙氨酰-tRNA合成酶(AARS1)具有乳酰转移酶活性,通过修饰YAP信号通量发挥促癌功能。
图形摘要:
Highlights如下:
1)AARS1的高表达与TNM分期及不良临床预后密切相关。
2)AARS1作为一种乳酸转移酶,可以直接利用乳酸和ATP来催化蛋白质的乳酸化。
3)机制上,AARS1能够结合并催化YAP和TEAD1发生乳酸化修饰,增强细胞核内YAP与TEAD1的相互作用,激活下游基因表达促进胃癌细胞增殖。此外,AARS1被发现是YAP-TEAD1的下游靶基因,形成一个正反馈调控环路。
临床相关性:AARS1的表达水平与幽门螺杆菌感染、肿瘤大小和肿瘤分期呈正相关。AARS1的高表达水平与GC患者的不良预后正相关
功能研究:AARS1转位到细胞核,激活下游靶基因表达,促进肿瘤细胞增殖。
机制研究:
(1)AARS1作为一种蛋白质乳酸转移酶,使用乳酸作为直接的乳酸供体
第一步,AARS1与乳酸存在结合
分子对接预测乳酸可以很容易地结合到AARS1的催化口袋上(图1a)。等温滴定量热法验证了该结果(图1b)。
第二步,确定AARS1是一种乳酸转移酶
体外乳酸化实验显示AARS1能够以依赖于乳酸和ATP的方式直接使组蛋白H3和H4乳酸化(图1c),随后的质谱分析也显示AARS1能直接在K18处乳酸化H3肽(图1d)。AARS1催化袋内氨基酸残基突变体(5M)消除了其乳酸转移酶活性(图1c-d)。表明乳酸结合对AARS1介导的蛋白乳酸化的必要性,并且AARS1直接使用乳酸作为乳酸供体。
第三步,AARS1可以直接与乳酸结合并将其转移到赖氨酸
由于L-丙氨酸与AARS1的亲和力略高于乳酸,因此在反应体系中加入L-丙氨酸可剂量依赖性地抑制AARS1介导的组蛋白H3乳酸化。表明AARS1可以直接与乳酸结合并将其转移到赖氨酸(图1e-f)。另外,敲低AARS1可降低蛋白质的乳酸化水平(图1g)。表明AARS1以ATP为能量源,乳酸为供体,直接催化蛋白质的乳酸化。
(2)AARS1易位到细胞核是对细胞内乳酸增加的反应
第一步,乳酸处理促进AARS1进入细胞核质
核分离实验发现,乳酸处理促进AARS1穿梭进入细胞核(图1h)。分析AARS1的氨基酸序列,发现其C端区域有一个进化保守的核定位信号(NLS)基序(图1i)。构建ΔNLS突变体,检测显示该突变体仅定位于细胞质中;此外,乳酸处理对ΔNLS突变体也没有作用(图1j)。
第二步,确定乳酸促进AARS1核易位的机制
具有NLS的蛋白质通常通过与输入蛋白α的相互作用被转运到细胞核中。乳酸化蛋白质组学显示,输入蛋白α亚基(KPNA1、3、4和6)被乳酸化。Co-IP实验发现KPNA4是AARS1的结合伙伴(图1k)。此外,Co-IP实验提示,乳酸促进AARS1与KPNA4互作,AARS1-ΔNLS突变体则消除这种互作(图1l)。表明KPNA4与AARS1的NLS基序结
合,介导其核转运。
图1 AARS1作为一种蛋白质乳酸转移酶,细胞内乳酸增加促进AARS1核易位(Ref. Fig 1/2/S1)
(3)YAP和TEAD1直接被AARS1乳酸化,被SIRT1去乙酰化
第一步,AARS1分别乳酸化YAP和TEADK90和K108位点
乳酸化蛋白质组学KEGG分析富集多种通路,重点集中在Hippo信号通路上,YAP和TEAD1分别在K90和K108位点发生了乳酸化(图2a-b)。IP-WB检测也显示YAP-TEAD发生乳酸化(图2c)。此外,构建YAP K90R和TEAD1 K108R突变体进行IP-WB检测显示没有发生乳酸化(图2d)。另外,葡萄糖剥夺降低YAP-TEAD1的乳酸化水平,而乳酸处理明显恢复其的乳酸化水平(图2e-f)。
第二步,AARS1与YAP-TEAD1相互作用
为了研究AARS1是否直接导致Hippo通路组分的乳酸化。Co-IP实验发现AARS1与YAP-TEAD1互作(图2g),细胞分离实验表明主要发生在细胞核内(图2h)。GST pulldown实验也显示AARS1和YAP-TEAD1直接互作(图2i-j)。体外乳酸化实验表明,AARS1能够直接使WT TEAD1乳酸化(图2k),但不能使其K108R突变体乳酸化(图2l)。
在HEK293FT细胞中,过表达WT AARS1而非其5M突变体促进了YAP-TEAD1的乳酸化(图2m),而敲低AARS1则显著降低了YAP-TEAD1的乳酸化水平(图2n)。表明AARS1与YAP-TEAD1相互作用,并使其乳酸化修饰。
图2 AARS1与YAP-TEAD1相互作用,并使其乳酸化修饰(Ref. Fig 2/S2)
第三步,YAP和TEAD直接被SIRT1去乙酰化
探索可能导致YAP去乙酰化的酶。Sirtuin(去乙酰化酶)抑制剂烟酰胺(NAM)处理细胞,显著增加了YAP的乳酸化(图3a)。对sirtuin去乙酰化酶家族成员(SIRT1-SIRT7)进行筛选,发现SIRT1的过表达显著降低了YAP的乳酸化水平(图3b)。同时,Co-IP实验显示SIRT1与YAP相互作用(图3c)。构建SIRT1的催化缺陷突变体(H363Y),Co-IP实验发现SIRT1的催化缺陷突变体(H363Y)未能降低细胞中YAP的乳酸化水平(图3d)。表明SIRT1使YAP和TEAD去乙酰化,导致YAP和TEAD乳酸化水平增加。
(4)YAP-TEAD的乳酸化促进Hippo通路靶基因的表达
第一步,YAP-TEAD的乳酸化促进Hippo通路靶基因的表达
质核分离分析显示,乳酸强烈促进WT YAP的核定位,但不促进其K90R突变体的核定位,表明乳酸诱导的YAP激活需要K90乳酸化(图3e)。Co-IP实验发现乳酸增强TEAD1与WT YAP的相互作用,而不是其K90R突变体(图3f)。此外,乳酸增加了过表达WT YAP的细胞中CTGF和CYR61的mRNA水平,但过表达YAP K90R突变体的影响较小(图3g)。ChIP实验显示,乳酸处理增强了WT TEAD1在CTGF和CYR61启动子上的占据,而不是其K108R突变体(图3h)。表明细胞内乳酸促进了YAP-TEAD1的乳酸化水平和转录活性。
第二步,YAP-TEAD1的乳酸化和泛素化之间的相互作用
核质分离实验显示,大部分乳酸化的YAP和TEAD1定位在细胞核内,而s127磷酸化的YAP或泛素化的YAP和TEAD1主要分布在细胞质内(图3i-j)。乳酸处理降低了YAP-TEAD1的泛素化水平(图3k),促进了AARS1的核定位及其与YAP-TEAD的相互作用。此外,WT AARS1促进了YAP-TEAD1的乳酸化,但ΔNLS突变体没有(图3l)。表明YAP的乳酸化破坏了其易位进入细胞质后进行的泛素化。
(5)AARS1是YAP-TEAD的直接靶基因
为了表征YAP-TEAD1在乳酸刺激下的全基因组特征基因,进行ChIP-Seq分析。发现YAP-TEAD1在AARS1的启动子上富集,表明AARS1是YAP-TEAD1的下游靶基因。此外,ChIP实验显示YAP-TEAD1与AARS1的启动子结合(图4C)。荧光素酶报告基因实验显示,YAP-TEAD1的过表达以剂量依赖的方式增加了WT载体的活性,但不影响突变载体的活性。结果表明,AARS1是YAP- tead1的直接靶基因,细胞内乳酸驱动AARS1和YAP- tead1之间的正反
馈回路。
图3 YAP-TEAD的乳酸化促进Hippo通路靶基因的表达,直接调控AARS1(Ref. Fig3/S2/3)
结论:该研究鉴定了AARS1是一种乳酸转移酶,可以直接利用乳酸和ATP来催化蛋白质的乳酸化。此外,为了响应细胞内乳酸的积累,AARS1易位进入细胞核,直接催化K90位点的YAP和K108位点的TEAD1的乳酸化,从而激活下游靶基因的表达,促进肿瘤细胞的增殖。另外,AARS1被证明是YAP-TEAD1的一个直接靶基因,形成一个正反馈回路。该研究揭示了代谢物乳酸通过AARS1放大器,促进肿瘤进展的分子机制。
2024年3月,同济大学、复旦大学及安徽科技大学等多单位合作在J Clin Invest(IF=13.3)上,发表“The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer”的研究成果,研究发现tRNA合成酶丙氨酰-tRNA合成酶(AARS1)具有乳酰转移酶活性,通过修饰YAP信号通量发挥促癌功能。
图形摘要:
Highlights如下:
1)AARS1的高表达与TNM分期及不良临床预后密切相关。
2)AARS1作为一种乳酸转移酶,可以直接利用乳酸和ATP来催化蛋白质的乳酸化。
3)机制上,AARS1能够结合并催化YAP和TEAD1发生乳酸化修饰,增强细胞核内YAP与TEAD1的相互作用,激活下游基因表达促进胃癌细胞增殖。此外,AARS1被发现是YAP-TEAD1的下游靶基因,形成一个正反馈调控环路。
临床相关性:AARS1的表达水平与幽门螺杆菌感染、肿瘤大小和肿瘤分期呈正相关。AARS1的高表达水平与GC患者的不良预后正相关
功能研究:AARS1转位到细胞核,激活下游靶基因表达,促进肿瘤细胞增殖。
机制研究:
(1)AARS1作为一种蛋白质乳酸转移酶,使用乳酸作为直接的乳酸供体
第一步,AARS1与乳酸存在结合
分子对接预测乳酸可以很容易地结合到AARS1的催化口袋上(图1a)。等温滴定量热法验证了该结果(图1b)。
第二步,确定AARS1是一种乳酸转移酶
体外乳酸化实验显示AARS1能够以依赖于乳酸和ATP的方式直接使组蛋白H3和H4乳酸化(图1c),随后的质谱分析也显示AARS1能直接在K18处乳酸化H3肽(图1d)。AARS1催化袋内氨基酸残基突变体(5M)消除了其乳酸转移酶活性(图1c-d)。表明乳酸结合对AARS1介导的蛋白乳酸化的必要性,并且AARS1直接使用乳酸作为乳酸供体。
第三步,AARS1可以直接与乳酸结合并将其转移到赖氨酸
由于L-丙氨酸与AARS1的亲和力略高于乳酸,因此在反应体系中加入L-丙氨酸可剂量依赖性地抑制AARS1介导的组蛋白H3乳酸化。表明AARS1可以直接与乳酸结合并将其转移到赖氨酸(图1e-f)。另外,敲低AARS1可降低蛋白质的乳酸化水平(图1g)。表明AARS1以ATP为能量源,乳酸为供体,直接催化蛋白质的乳酸化。
(2)AARS1易位到细胞核是对细胞内乳酸增加的反应
第一步,乳酸处理促进AARS1进入细胞核质
核分离实验发现,乳酸处理促进AARS1穿梭进入细胞核(图1h)。分析AARS1的氨基酸序列,发现其C端区域有一个进化保守的核定位信号(NLS)基序(图1i)。构建ΔNLS突变体,检测显示该突变体仅定位于细胞质中;此外,乳酸处理对ΔNLS突变体也没有作用(图1j)。
第二步,确定乳酸促进AARS1核易位的机制
具有NLS的蛋白质通常通过与输入蛋白α的相互作用被转运到细胞核中。乳酸化蛋白质组学显示,输入蛋白α亚基(KPNA1、3、4和6)被乳酸化。Co-IP实验发现KPNA4是AARS1的结合伙伴(图1k)。此外,Co-IP实验提示,乳酸促进AARS1与KPNA4互作,AARS1-ΔNLS突变体则消除这种互作(图1l)。表明KPNA4与AARS1的NLS基序结
合,介导其核转运。
图1 AARS1作为一种蛋白质乳酸转移酶,细胞内乳酸增加促进AARS1核易位(Ref. Fig 1/2/S1)
(3)YAP和TEAD1直接被AARS1乳酸化,被SIRT1去乙酰化
第一步,AARS1分别乳酸化YAP和TEADK90和K108位点
乳酸化蛋白质组学KEGG分析富集多种通路,重点集中在Hippo信号通路上,YAP和TEAD1分别在K90和K108位点发生了乳酸化(图2a-b)。IP-WB检测也显示YAP-TEAD发生乳酸化(图2c)。此外,构建YAP K90R和TEAD1 K108R突变体进行IP-WB检测显示没有发生乳酸化(图2d)。另外,葡萄糖剥夺降低YAP-TEAD1的乳酸化水平,而乳酸处理明显恢复其的乳酸化水平(图2e-f)。
第二步,AARS1与YAP-TEAD1相互作用
为了研究AARS1是否直接导致Hippo通路组分的乳酸化。Co-IP实验发现AARS1与YAP-TEAD1互作(图2g),细胞分离实验表明主要发生在细胞核内(图2h)。GST pulldown实验也显示AARS1和YAP-TEAD1直接互作(图2i-j)。体外乳酸化实验表明,AARS1能够直接使WT TEAD1乳酸化(图2k),但不能使其K108R突变体乳酸化(图2l)。
在HEK293FT细胞中,过表达WT AARS1而非其5M突变体促进了YAP-TEAD1的乳酸化(图2m),而敲低AARS1则显著降低了YAP-TEAD1的乳酸化水平(图2n)。表明AARS1与YAP-TEAD1相互作用,并使其乳酸化修饰。
图2 AARS1与YAP-TEAD1相互作用,并使其乳酸化修饰(Ref. Fig 2/S2)
第三步,YAP和TEAD直接被SIRT1去乙酰化
探索可能导致YAP去乙酰化的酶。Sirtuin(去乙酰化酶)抑制剂烟酰胺(NAM)处理细胞,显著增加了YAP的乳酸化(图3a)。对sirtuin去乙酰化酶家族成员(SIRT1-SIRT7)进行筛选,发现SIRT1的过表达显著降低了YAP的乳酸化水平(图3b)。同时,Co-IP实验显示SIRT1与YAP相互作用(图3c)。构建SIRT1的催化缺陷突变体(H363Y),Co-IP实验发现SIRT1的催化缺陷突变体(H363Y)未能降低细胞中YAP的乳酸化水平(图3d)。表明SIRT1使YAP和TEAD去乙酰化,导致YAP和TEAD乳酸化水平增加。
(4)YAP-TEAD的乳酸化促进Hippo通路靶基因的表达
第一步,YAP-TEAD的乳酸化促进Hippo通路靶基因的表达
质核分离分析显示,乳酸强烈促进WT YAP的核定位,但不促进其K90R突变体的核定位,表明乳酸诱导的YAP激活需要K90乳酸化(图3e)。Co-IP实验发现乳酸增强TEAD1与WT YAP的相互作用,而不是其K90R突变体(图3f)。此外,乳酸增加了过表达WT YAP的细胞中CTGF和CYR61的mRNA水平,但过表达YAP K90R突变体的影响较小(图3g)。ChIP实验显示,乳酸处理增强了WT TEAD1在CTGF和CYR61启动子上的占据,而不是其K108R突变体(图3h)。表明细胞内乳酸促进了YAP-TEAD1的乳酸化水平和转录活性。
第二步,YAP-TEAD1的乳酸化和泛素化之间的相互作用
核质分离实验显示,大部分乳酸化的YAP和TEAD1定位在细胞核内,而s127磷酸化的YAP或泛素化的YAP和TEAD1主要分布在细胞质内(图3i-j)。乳酸处理降低了YAP-TEAD1的泛素化水平(图3k),促进了AARS1的核定位及其与YAP-TEAD的相互作用。此外,WT AARS1促进了YAP-TEAD1的乳酸化,但ΔNLS突变体没有(图3l)。表明YAP的乳酸化破坏了其易位进入细胞质后进行的泛素化。
(5)AARS1是YAP-TEAD的直接靶基因
为了表征YAP-TEAD1在乳酸刺激下的全基因组特征基因,进行ChIP-Seq分析。发现YAP-TEAD1在AARS1的启动子上富集,表明AARS1是YAP-TEAD1的下游靶基因。此外,ChIP实验显示YAP-TEAD1与AARS1的启动子结合(图4C)。荧光素酶报告基因实验显示,YAP-TEAD1的过表达以剂量依赖的方式增加了WT载体的活性,但不影响突变载体的活性。结果表明,AARS1是YAP- tead1的直接靶基因,细胞内乳酸驱动AARS1和YAP- tead1之间的正反
馈回路。
图3 YAP-TEAD的乳酸化促进Hippo通路靶基因的表达,直接调控AARS1(Ref. Fig3/S2/3)
结论:该研究鉴定了AARS1是一种乳酸转移酶,可以直接利用乳酸和ATP来催化蛋白质的乳酸化。此外,为了响应细胞内乳酸的积累,AARS1易位进入细胞核,直接催化K90位点的YAP和K108位点的TEAD1的乳酸化,从而激活下游靶基因的表达,促进肿瘤细胞的增殖。另外,AARS1被证明是YAP-TEAD1的一个直接靶基因,形成一个正反馈回路。该研究揭示了代谢物乳酸通过AARS1放大器,促进肿瘤进展的分子机制。