一、制备CaCl2感受态细胞的操作步骤
1. 首先，需在前一晚接种受体菌（选择DH5α或DH10B），并从LB培养基中挑取单个菌落，置于37℃的摇床中培养一整夜，大约16小时。
2. 随后，取1毫升过夜培养物，转移到含有100毫升LB培养基的容器中，于37℃摇床上以250-300转/分钟的速度剧烈振荡培养2.5至3小时。
3. 提前将0.1摩尔的CaCl2溶液放置于冰上预冷备用。
接下来的操作需在超净工作台并保持在冰上进行：
4. 吸取1.5毫升培养好的菌液到1.5毫升离心管中，冰上静置10分钟以冷却。
5. 在4℃条件下，以3000转/分钟的速度冷冻离心5分钟。
6. 去除上清液后，加入100微升预冷的0.1摩尔CaCl2溶液，用移液枪轻柔地上下吸动，使细胞重新悬浮，然后在冰上放置20分钟。
7. 再次在4℃下以3000转/分钟的速度冷冻离心5分钟。
8. 弃去上清，再次加入100微升预冷的0.1摩尔CaCl2溶液，轻轻吸动使细胞悬浮。
9. 制备好的细胞悬浮液可以直接用于转化实验，或者加入15%至20%的甘油作为冷冻保护剂后，存储在-70℃的超低温环境中备用。
二、电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的操作步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），并挑取单菌落置于LB培养基中，在37℃摇床上培养过夜。
2. 次日，取2毫升过夜培养物加入到200毫升LB培养基中，于37℃摇床上剧烈振荡培养，直至OD600达到0.6（大约需要2.5至3小时）。
3. 迅速将菌液转移到冰上冷却。
以下步骤需在超净工作台并保持在冰上操作：
4. 取1.5毫升培养好的菌液至1.5毫升离心管中，冰上冷却10分钟。
5. 在4℃条件下，以3000转/分钟的速度冷冻离心5分钟。
6. 去除上清后，加入1500微升冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻吸动使细胞悬浮。
7. 再次以相同条件冷冻离心5分钟。
8. 弃去上清，加入750微升冰冷的10%甘油，轻轻吸动使细胞重新悬浮。
9. 重复冷冻离心步骤。
10. 最后加入20微升冰冷的10%甘油，轻轻吸动使细胞悬浮。
11. 制备好的感受态细胞可立即使用，或置于-70℃超低温环境中保存。
三、影响感受态细胞转化效率的关键因素及操作注意事项
1. 细菌生长状态：需密切关注细菌的生长状态和密度，优选对数生长期的细胞（DH5α菌株OD600为0.5时，细胞密度约为5×107/毫升）。
2. 无菌与低温操作：所有操作均应在无菌条件下进行，并保持在冰上以降低细胞活性。
3. CaCl2处理与转化率：经CaCl2处理的细胞在低温下，转化率会随时间逐渐增加，24小时达到峰值，随后因活菌数减少而下降。
4. 化合物与离子影响：在Ca2+基础上，联合使用其他二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等，可显著提升转化效率（100-1000倍）。
5. 器皿清洁度：使用的器皿必须彻底清洁，避免残留的去污剂或其他化学物质降低转化效率。
6. 质粒特性：转化时应优先选择超螺旋结构的DNA质粒。
7. DNA浓度与转化效率：在一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度成正比关系。
1. 首先，需在前一晚接种受体菌（选择DH5α或DH10B），并从LB培养基中挑取单个菌落，置于37℃的摇床中培养一整夜，大约16小时。
2. 随后，取1毫升过夜培养物，转移到含有100毫升LB培养基的容器中，于37℃摇床上以250-300转/分钟的速度剧烈振荡培养2.5至3小时。
3. 提前将0.1摩尔的CaCl2溶液放置于冰上预冷备用。
接下来的操作需在超净工作台并保持在冰上进行：
4. 吸取1.5毫升培养好的菌液到1.5毫升离心管中，冰上静置10分钟以冷却。
5. 在4℃条件下，以3000转/分钟的速度冷冻离心5分钟。
6. 去除上清液后，加入100微升预冷的0.1摩尔CaCl2溶液，用移液枪轻柔地上下吸动，使细胞重新悬浮，然后在冰上放置20分钟。
7. 再次在4℃下以3000转/分钟的速度冷冻离心5分钟。
8. 弃去上清，再次加入100微升预冷的0.1摩尔CaCl2溶液，轻轻吸动使细胞悬浮。
9. 制备好的细胞悬浮液可以直接用于转化实验，或者加入15%至20%的甘油作为冷冻保护剂后，存储在-70℃的超低温环境中备用。
二、电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的操作步骤
1. 前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），并挑取单菌落置于LB培养基中，在37℃摇床上培养过夜。
2. 次日，取2毫升过夜培养物加入到200毫升LB培养基中，于37℃摇床上剧烈振荡培养，直至OD600达到0.6（大约需要2.5至3小时）。
3. 迅速将菌液转移到冰上冷却。
以下步骤需在超净工作台并保持在冰上操作：
4. 取1.5毫升培养好的菌液至1.5毫升离心管中，冰上冷却10分钟。
5. 在4℃条件下，以3000转/分钟的速度冷冻离心5分钟。
6. 去除上清后，加入1500微升冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻吸动使细胞悬浮。
7. 再次以相同条件冷冻离心5分钟。
8. 弃去上清，加入750微升冰冷的10%甘油，轻轻吸动使细胞重新悬浮。
9. 重复冷冻离心步骤。
10. 最后加入20微升冰冷的10%甘油，轻轻吸动使细胞悬浮。
11. 制备好的感受态细胞可立即使用，或置于-70℃超低温环境中保存。
三、影响感受态细胞转化效率的关键因素及操作注意事项
1. 细菌生长状态：需密切关注细菌的生长状态和密度，优选对数生长期的细胞（DH5α菌株OD600为0.5时，细胞密度约为5×107/毫升）。
2. 无菌与低温操作：所有操作均应在无菌条件下进行，并保持在冰上以降低细胞活性。
3. CaCl2处理与转化率：经CaCl2处理的细胞在低温下，转化率会随时间逐渐增加，24小时达到峰值，随后因活菌数减少而下降。
4. 化合物与离子影响：在Ca2+基础上，联合使用其他二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等，可显著提升转化效率（100-1000倍）。
5. 器皿清洁度：使用的器皿必须彻底清洁，避免残留的去污剂或其他化学物质降低转化效率。
6. 质粒特性：转化时应优先选择超螺旋结构的DNA质粒。
7. DNA浓度与转化效率：在一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度成正比关系。
