第一步，确定调节YBX1表达的潜在机制---泛素-蛋白酶体降解途径
为了进一步确定调节YBX1表达的潜在机制，泛素-蛋白酶体降解途径和自噬-溶酶体途径是细胞内蛋白质降解的两种重要途径。用MG132、3MA和CQ处理原代神经元（3MA是一种广泛使用的抑制细胞自噬的抑制剂，可抑制III类PI3K；CQ通过增加酸性内体/溶酶体的pH值来破坏溶酶体功能；MG132是一种广泛使用的泛素-蛋白酶体降解途径抑制剂。），发现MG132处理后，YBX1的表达水平升高（图2a）。表明泛素-蛋白酶体降解途径可能是YBX1在神经元中的主要调节机制。
第二步，确定TRIM56与YBX1相互作用
IP-MS和分子对接分析显示，E3泛素连接酶TRIM56与YBX1强结合（图2b-e）。细胞水平内源性、外源性Co-IP实验证实TRIM56与YBX1相互作用（图2f-h）。另外，Co-IP实验分析发现，在SCI模型小鼠和OGD处理过的神经元中，TRIM56的表达及其与YBX1的结合均减少（图2i-j）。表明TRIM56与YBX1之间存在相互作用。
第三步，确定TRIM56与YBX1相互作用的结合区域
构建一系列截短的Myc标签YBX1载体，进行Co-IP实验，以确定YBX1 TRIM56特异性结合的区域。Co-IP结果显示，TRIM56仅与YBX1的M3(Δ126-324)片段结合（图2k-l）。表明TRIM56与YBX1之间存在直接相互作用。
全文分享请查阅：【《Adv Sci》解读：泛凋亡！TRIM56调节YBX1泛素化降解，改善脊髓损伤中ZBP1介导的神经元PANoptosis】。
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